Embriogenesis Somatik

Embriogenesis somatik merupakan suatu proses pembentukan embrio dari sel somatik menjadi tumbuhan baru, tanpa melalui fusi sel gamet. Cara ini dinilai lebih cepat dan efisien, karena setiap sel somatik berpotensi untuk menjadi 1 individu baru. Embrio somatik dicirikan dengan strukturnya yang bipolar, yaitu mempunyai dua calon meristem, meristem akar dan meristem tunas. Embrio somatik dapat melalui dua jalur pembentukan, yaitu secara langsung maupun tidak langsung (melalui fase kalus).

Embriogenesis somatik mempunyai beberapa tahapan spesifik,yaitu (1) induksi sel dan kalus embriogenik, (2) pendewasaan, (3) perkecambahan, dan (4) aklimatisasi.

1.      Induksi sel dan kalus embriogenik

Sebelum dilakukan induksi sel, eksplan terlebih dahulu dilakukan sterilisasi permukaan. Induksi sel dan kalus embriogenik pada umumnya dilakukan dengan penambahan zat pengatur tumbuh pada medium pertumbuhannya dalam konsentrasi yang tinggi agar mempunyai daya aktivitas yang kuat. Zat pengatur tumbuh yang biasa digunakan yaitu, auksin (antara lain 2,4-D) dan sitokinin (antara lain kinetin). Kalus embriogenik ditandai dengan pembentukan struktur kalus yang friable (remah dan mudah terpisah) serta berwarna putih atau kekuningan yang muncul sekitar 2,5 bulan. Selanjutnya akan terbentuk struktur pasangan-pasangan berbentuk kepingan berwarna putih yang menandakan terbentuknya embrio. Total embrio yang terbentuk dari 1 helai daun yaitu sekitar 1000 embrio (Roostika et al., 2009).

2.      Pendewasaan

Pada tahap pendewasaan, struktur globular akan berkembang membentuk kotiledon dan primordia akar. Pembentukan diawali dengan pembentukan struktur bipolar (2 kutub). Perkembangan kalus embriogenik dipengaruhi oleh kondisi hormon endogen dan eksogen (zat pengatur tumbuh). Ketika konsentrasi auksin lebih tinggi dari sitokinin, maka pertumbuhan akar akan lebih dominan. Sebaliknya jika konsentrasi sitokinin lebih tinggi dari auksin, maka yang dominan terbentu adalah tunas. Pada tahap pendewasaan sering digunakan zat pengatur tumbuh pada konsentrasi yang rendah. Perkembangan kalus embriogenik menjadi planlet dimulai dengan terbentuknya struktur globular, hati, torpedo dan kotiledon (gambar 1).

Gambar 1. Urutan perkembangan kalus embriogenik. (A) struktur globular, (B) struktur hati, (C) struktur torpedo, (D) struktur kotiledon awal, (E) kotiledon akhir (Roostika et al., 2009)

3.      Perkecambahan

Pada tahap perkecambahan, embrio somatik akan membentuk tunas dan akar. Zat pengatur tumbuh yang digunakan dalam medium pertumbuhan berada dalam konsentrasi yang sangat rendah, bahkan tidak digunakan sama sekalu. Berdasarkan penelitian Roostika et al. (2009), penambahan auksin ke dalam medium pertumbuhan justru tidak mampu meningkatkan persentase pembentukan planlet. Hal ini diduga bahwa kandungan auksin endogen dalam kalus mebriogenik cukup tinggi sehingga tidak memerlukan auksin eksogen. Pembentukan tunas lebih diharapkan daripada pembentukan akar karena induksi perakaran dari eksplan tunas lebih mudah dibandingkan dengan induksi tunas dari eksplan akar.

4.      Aklimatisasi

Bibit embrio somatik diaklimatisasi terlebih dahulu sebelum ditanam di lingkungan agar terjadi penyesuaian. Keberhasilan aklimatisasi ditandai dengan munculnya sepasang daun merah (Roostika et al., 2005). Pada penelitian Roostika et al. (2009), persentase tingkat keberhasilan aklimatisasi hanya sebesar 14%. Rendahnya tingkat aklimatisasi kemungkinan disebabkan penguapan planlet yang tinggi karena masih mempunyai kutikula yang tipis. Van Huylenbroeck dan Debergh (1996) menyebutkan bahwa selama proses aklimatisasi, planlet harus beradaptasi terhadap lingkungan baru, seperti tingkat kelembaban yang rendah, tingkat intensitas cahaya yang tinggi, fluktuasi suhu dan stress penyakit.

Pembentukan embrio somatik dipengaruhi oleh berbagai faktor, antara lain jenis eksplan, sumber nitrogen dan gula, serta zat pengatur tumbuh (Purnamaningsih, 2002).

a.       Jenis eksplan

Penggunaan jenis eksplan yang bersifat meristematik dapat meningkatkan keberhasilan dalam embriogenesis somatik. Jenis eksplan yang umum digunakan antara lain, aksis embrio zigotik muda dan dewasa, kotiledon, mata tunas, dan epikotil maupun hipokotil.

b.       Sumber nitrogen dan gula

Komposisi nutrisi dalam medium berperan penting dalam induksi dan perkembangan embryogenesis somatik. Nitrogen merupakan faktor utama dalam memacu morfogenesis secara in vitro. Menurut Ammirato (1983), bentuk nitrogen reduksi (seperti NH₄⁺ dan NO₃^-) dan beberapa asam amino (seperti glutamin dan kasein hidrolisat) dapat membantu proses inisiasi dan perkembangan embrio somatik. Young et al. (1999) dalam  Purnamaningsih (2002) menambahkan bahwa penambahan asam amino dapat merangsang terjadinya komunikasi di antara sel dan jaringan pada organ multiseluler. Akan tetapi, konsentrasi NO₃^- yang terlalu tinggi dapat meningkatkan pH medium sehingga kalus tidak membentuk embrio somatik.

Selain nitrogen, gula juga merupakan komponen nutrisi yang harus diberikan ke medium pertumbuhan. Gula berfungsi sebagai sumber karbon dan mempertahankan tekanan osmotik pada medium. Anhazhagan dan Ganapathi mengamati pengaruh beberapa jenis gula (glukosa, sukrosa, fruktosa, dan maltosa) terhadap pembentukan kalus embriogenik. Penambahan sukrosa ke dalam medium kultur menghasilkan jumlah embrio somatik paling banyak dibandingkan jenis gula yang lain (tabel 1).

c.       Zat pengatur tumbuh

Zat pengatur tumbuh merupakan suatu senyawa organik yang berperan dalam pertumbuhan dan perkembangan kultur. Konsentrasi yang digunakan berbeda-beda tergantung dari fase pertumbuhan yang terjadi. Konsentrasi yang tinggi diberikan pada tahap induksi sel, sedangkan pada tahap pendewasaan zat pengatur tumbuh diberikan dengan konsentrasi yang rendah. Macam zat pengatur tumbuh tersebut dapat berupa auksin (2,4-D; 3,5-T; picloram; dan NAA), dan sitokinin ( Benzil adedin/BA, kinetin, dan adenine sulfat). Zat pengatur tumbuh yang paling sering digunakan adalah auksin sintetik 2,4-D karena efektif  untuk induksi kalus embriogenik dan tahap terhadap degradasi reaksi enzimatik maupun fotooksidasi.

Tabel 1. Pengaruh penggunaan karbohidrat dan konsentrasi 2,4-D terhadap embryogenesis somatik pada kultur suspensi

                        Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama

                        tidak berbeda nyata berdasarkan uji DMRT taraf 5%. Perlakuan

                        dari 10 ulangan.

Perbandingan penggunaan zat pengatur tumbuh dilakukan pada penelitian Roostika et al. (2009). Dua macam zat pengatur tumbuh yang digunakan yaitu auksin (IBA dan NAA), serta sitokinin (BA dan kinetin). Hasil penelitiannya menunjukkan bahwa penggunaan auksin lebih efektif untuk perkembangan kalus embriogenik dibandingkan dengan sitokinin (gambar 2).

  

Gambar 2. Pengaruh auksin dan sitokinin terhadap regenerasi kalus embriogenik lengkeng Diamond river yang ditanam pada medium yang mengandung sukrosa 1&, 2 bulan setelah tanam.

Proses pembentukan embriogenesis somatik dikendalikan oleh berbagai gen yang saling terkait. Hiwatashi dan Fukuda (2000) mengisolasi 6 homeobox gen (CHBs) yang dikelompokkan sebagai famili HD (homeo-domain) Zip I dari embrio dan bibit wortel. Hasil analisis menunjukkan bahwa jumlah m-RNA dari gen CHB3, CHB4, CHB5, dan CHB6 meningkat sesuai dengan perkembangan embrio somatik. Akumulasi m-RNA dari gen-gen tersebut tampak pada beberapa lokasi yang berbeda dalam embrio dan bibit wortel sesuai dengan tahap perkembangannya.

Pada embrio, akumulasi m-RNA dari CHB3 terlihat pada bagian aksis embrio pada fase globular, sedangkan pada awal fase hati sampai akhir torpedo, akumulasi m-RNA dari CHB3 tampak pada bagian paling dalam dari sel-sel korteks. Lapisan paling dalam dari sel-sel korteks tersebut berbeda dengan sel-sel korteks lain di mana lapisan tersebut banyak mengandung vakuola dan plastida. Lapisan ini akan berdiferensiasi membentuk sistim pembuluh. Ekspresi dari gen CHB4 dan CHB5 mulai terlihat pada fase torpedo. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa ekspresi dari gen CHB3, CHB4, dan CHB5 kemungkinan berhubungan dengan diferensiasi dari lapisan sel-sel korteks yang paling dalam. Peningkat-an jumlah m-RNA dari gen CHB6 terlihat pada jaringan pembuluh yang masih muda dari fase hati hingga terbentuknya embrio somatik. Hal ini menunjukkan bahwa gen CHB6 kemungkinan berhubungan dengan diferensiasi dan perkembangan sistem pembuluh. Secara skematik ekspresi dari keempat gen tesebut dan hubungannya dengan tahap perkembangan embriogenesis disajikan pada gambar 2.

Gambar 2. Akumulasi m-RNA dari CHB yang berbeda-beda selama embriogenesis somatik

  

Daftar Pustaka

Ammirato, P.V. 1983. Embryogenesis. In D.A. Evans, W.R. Sharp, P.V. Ammirato, and Y. Yamada. (Eds.). Handbook of Plant Cell Culture. 1: 82-123.

Anhazhagan, V.R. dan A. Ganapathi. 1999. Somatic embryogenesis in cell suspension cultures of pigeon (Cajanus cajan). Plant Culture, Tissue, and Organ Culture. 56: 179-184.

Hiwatashi, Y. dan H. Fukuda. 2000. Tissue specific localization of m-RNA for carrot homeobox genes CHBs in carrot somatic embryos. Plant Cell Physiol. 41(5):639-643.

Purnamaningsih, R. 2002. Regenerasi tanaman melalui embriogenesis somatik dan beberapa gen yang mengendalikannya. Bul AgriBio 5 (2): 51-58.

Roostika, I., V.N. Arief dan N. Sunarlim. 2009. Regenerasi kultur lengkeng dataran rendah cv. Diamond river melalui embriogenesis somatik. J Hort 19 (1): 14-22.

Van Huylenbroeck dan P.C. Debergh. 1996. Physiological aspect in acclimatization of micropropagation plantlets. Plant Tissue Culture and Biotechnology. 2 (3): 136-141.